新型酿酒酵母表面展示系统的构建及鸡球虫EtMic2活载体疫苗的免疫保护性研究

【摘要】随着DNA技术的发展，微生物的表面展示技术也有长足进步。所谓的表面展示技术是指利用微生物自身的表达系统，将表达的外源肽或蛋白质通过锚定蛋白锚定在微生物细胞的表面。微生物表面展示系统广泛应用于开发全细胞催化剂、研究蛋白质间的相互作用、筛选抗体和研发口服活载体疫苗等方面。除了噬菌体展示，细菌表面展示和酵母表面展示也相继报道。现有的酵母表面展示系统，根据锚定蛋白不同，分为凝集素展示系统和絮凝素展示系统。最常用的且已商品化的酿酒酵母展示系统是EBY100/pYD1（Invitrogen），此系统不适用于酵母野株，表达菌需要进行基因工程改造替换AGA1启动子为GAL1-10，在表达菌的选择方面受到了极大的限制，急需构建适应性强、操作简单的新型表面展示系统。随着禁用药物法规的出台和耐药虫株的出现，免疫预防成为控制球虫病的主要措施。鉴于球虫生活史复杂，蛋白表达具有阶段性等特点，目前有效疫苗较少。微线蛋白-2（EtMic2）作为一种与球虫入侵相关的粘附蛋白，能诱导鸡体对球虫产生一定的免疫保护作用。酿酒酵母是公认的益生菌，不但对机体安全无毒，而且能够有效刺激机体的非特异免疫，提高免疫力。以酵母作为表达载体，制备的疫苗在抗菌、抗病毒方面显示了很好的疗效。同时，酵母菌有类似高等生物的翻译后修饰机制，在表达真核生物蛋白（如：柔嫩艾美尔球虫）方面比细菌等更具优势。尽管，有研究表明，酵母的发酵产物具有一定抗球虫感染的作用，然而，利用酵母制备抗球虫的口服活载体疫苗还未见报道。刺激机体提高免疫力的有效成分是酵母细胞壁，利用双向电泳比较疫苗株与原酵母株的差异蛋白组，以期评价EtMic2的展示对酵母细胞壁蛋白组的影响。1、新型酿酒酵母表面展示系统的构建本研究，以一个带有双向启动子的质粒pSP-G2为基础质粒，分别将AGA1和AGA2表达盒克隆至pSP-G2双向启动子PGK1和TEF1下游，表达G418的抗性基因KanM作为筛选标记，构建酵母展示质粒pYSD。将EGFP和EtMIC2克隆至AGA2表达盒下游，并分别转染酵母野株（CICC1224和HAO）和基因工程菌（EBY100和W303-1A），EGFP和EtMic2的展示，表明新型酿酒酵母展示系统构建成功。为检测酿酒酵母自身Aga2p的表达对外源蛋白的展示有无影响，构建EBY100△aga2，分别转染pYSD-EtMIC2，结果表明，EBY100基因组Aga2p对外源蛋白的展示无影响。为检测外源蛋白的展示是否对酵母细胞本身的生长产生影响，对转化有不同质粒的酵母细胞（HAO/pYSD、HAO/pYSD–EtMIC2和HAO/pYSD-GFP）和空白酵母（HAO）进行了生长曲线和倍增时间的测定。结果表明不同菌株的生长曲线相似，倍增时间无差异，因此，外源蛋白（EGFP和EtMic2）的展示没有改变酵母细胞的生长特性，对其生长无影响。pYSD展示质粒含有表面展示所需的所有元件，因此，新型酿酒酵母展示系统操作简便，不受表达菌的限制，可同时适用于酵母野株和工程菌。2、EtMic2口服酵母疫苗的制备及其免疫保护效果的评价为进一步确定EtMic2的展示，选择100mM的二硫苏糖醇（DTT）还原Aga1p和Aga2p-EtMic2之间的二硫键，用EtMic2单抗进行WesternBlot鉴定。确定表达后，将展示有EtMic2的全酵母细胞（HAO/pYSD-EtMIC2）口服免疫雏鸡，分别设白对照，红对照，空质粒对照（HAO/pYSD）,免疫三周后，攻柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊3000个/只，白对照除外。对各组免疫鸡采血，分离血清，用间接ELISA方法测定血清中抗体水平和细胞因子，用MTT法检测细胞免疫水平。结果表明，HAO/pYSD-EtMIC2能诱导有效的细胞免疫和体液免疫反应；攻虫后，HAO/pYSD-EtMIC2组能提高相对增重为80.9%，卵囊减少率达76.56%，盲肠病变计分为2.3±0.46，表明能对E.tenella产生一定的免疫保护作用。3、EtMic2的展示对酵母细胞壁蛋白的影响刺激机体提高免疫力的有效成分是酵母细胞壁，应用双向电泳及质谱技术比较分析疫苗株（HAO/pYSD-EtMIC2）和空白酵母（HAO）的细胞壁蛋白，在相同处理条件下，通过蛋白质双向电泳分离两株酵母菌得到约210个蛋白点，选取两者差异表达2倍以上的点20个，其中，14个点在HAO/pYSD-EtMIC2中表达上调，6个点在HAO/pYSD-EtMIC2中表达下调，进行质谱分析，4个蛋白点测序未成功。16个测序成功的蛋白中，按蛋白功能分为4类，分别与细胞骨架相关蛋白、催化酶、功能代谢蛋白、蛋白合成和凋亡相关蛋白，主要参与糖酵解途径、蛋白分泌途径、氧化应激、氨基酸代谢途径等。
【作者】孙慧；
【导师】赵孝民；
【作者基本信息】山东农业大学，预防兽医学，2014，博士
【关键词】酿酒酵母；表面展示；微线蛋白2；口服疫苗；细胞壁蛋白；

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